Изготовление гистологических препаратов костной ткани

Метод изготовления костных препаратов

Изготовление гистологических препаратов костной ткани

Студенты, аспиранты, молодые ученые, использующие базу знаний в своей учебе и работе, будут вам очень благодарны.

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Метод изготовления костных препаратов

Лютенко Михаил Анатольевич

магистр физиологии человека и животных

fАннотация

Особенностью проведения учебных занятий на кафедре анатомии человека в медицинских вузах является использование натуральных анатомических препаратов на практических занятиях, в лекционном курсе, а также для выполнения студентами самостоятельной и индивидуальной научной работы, кроме этого, для пополнения экспозиции учебного анатомического музея. Нами был предложен гидротермостат для обработки костного материала и изготовления мацерированных препаратов, на который был получен патент на изобретение № 2161472 “Гидротермостат для обработки костного материала”. Данный аппарат позволяет значительно сократить время и улучшить качество изготовления костных и мацерированных препаратов.

Ключевые слова

кости; мацерация; анатомический музей

fAbstract

Feature of the training lessons in department anatomic in medical university is the using natural anatomical specimens. In practical classes, in lectures as well as for students themselves and as well individual work replenish exposure anatomical educational museum.

We proposed gidrotermostat for treatment of bone material and manufacture of matserirovanyh preparations, a patent for the invention “Gidrotermostat for treatmant of bone material”.

This apparatus can significantly reduce the time and improve the quality of manufacturing bone and matcerirovanyh preparations.

Keywords

bones; matcerirovanyh; anatomical museum

fПостановка проблемы и анализ последних исследований.

Особенностью проведения практических занятий на кафедрах анатомии человека в медицинских вузах является использование натуральных анатомических препаратов на практических занятиях, в лекционном курсе, а также для выполнения студентами самостоятельной и индивидуальной научной работы [4]. Кроме этого, костные препараты используются для пополнения экспозиции учебного анатомического музея [1-3]. В этой связи периодически возникает вопрос об изготовлении натуральных препаратов органов и систем тела человека. Особенно актуальна эта проблема при изучении раздела “Остеология” и “Синдесмология” так как изготовление костных натуральных препаратов всегда представляет определенную трудность в виду особой трудоемкости, больших материальных затрат и времени [3, 5].

Цель исследования. Разработать дешевый и быстрый способ качественной обработки костного материала.

Материал и методы исследования. Способ основан на термическом действии кипящей воды и растворенными в ней щелочами на все мягкие ткани, находящиеся вне- и внутри кости, что способствует их отделению и ускоряет процесс расщепления жиров.

Результаты исследования.

Для достижения этих целей нами был предложен гидротермостат для обработки костного материала и изготовления мацерированных препаратов, на который был получен патент на изобретение № 2161472 “Гидротермостат для обработки костного материала”.

Данный аппарат позволяет значительно сократить время и улучшить качество изготовления костных мацерированных препаратов. Все этапы обработки костного материала (термическая обработка, мацерация, обезжиривание и отбеливание) можно проводить в данном аппарате.

Данный универсальный аппарат для изготовления костных препаратов состоит из цилиндрического бака имеющего снаружи кожух с термопрослойкой, крышки с вытяжной трубой и двумя термометрами, системы электронагрева с подключенного к терморегулятору, контрольной трубки для отслеживания процесса мацерации, канализационного стока расположенного в центра дна бака. Внутри на дно аппарата вкладывается металлическая подставка – решетка, отделяющая нагревательный элемент от обрабатываемого материала. По верхнему краю бака имеется паз, в который вложено кольцо из микропористой резины для герметизации с крышкой.

Система терморегуляции аппарата состоит из пускотерморегуляционного устройства, нагревательного элемента контактного и контрольного термометров – находящихся в крышке и защищенных специальными чехлами.

При работе аппарата в системе кипения контактный термометр отключается и температура не регулируется, а при работе в системе мацерации и отбеливания можно выставлять электрод контактного термометра на заданную температуру и при ее достижении нагревательный элемент отключается.

При эксплуатации аппарата в режиме “термореле” при мацерации, нужно периодически следить за работой контактного термометра по контрольной лампочке расположенной на корпусе термопускателя, которая включается в момент нагрева.

Процесс подготовки костного материала для его дальнейшей обработки в аппарате состоит в следующем:

1. Перед началом процесса обработки очищенные от мягких тканей кости, заложенные в бак аппарата промывают и вымачивают в воде 1-2 дня. При этом мелкие кости кисти и стопы помещают в марлевый мешочек, что бы в процессе обработки они не растерялись.

2. Промытый материал заливают свежей водой с добавлением кальценированной соды, из расчета 20 гр. соды на 1000 мл воды и начинают процесс обработки.

3. После первичной термической обработки или мацерации кости извлекают из бака и очищают от остатков мягких тканей жесткой щеткой, после промывают под проточной водой. Процесс вновь повторяют. Общее время термической обработки костей скелета взрослого человека 5 -7 часов.

Процесс мацерации костного материала проводят при необходимости сохранить хрящевую ткань. Это изготовление скелетов плодов, скелетов детского возраста и скелетов мелких животных.

Процесс мацерации осуществляется в данном универсальном аппарате следующим образом:

1. Удалив мышцы, стараясь не повредить связки и суставы, материал помещают в мешочек из синтетической ткани или специальный сетчатый полиэтиленовый контейнер и укладывают в аппарат на предварительно выставленную на его дне подставку-решетку.

2. Заложенный в аппарат материал заливают водой, закрывают герметически крышку и устанавливают контактный термометр на 37-39°С.

3. Выдерживают материал 1- 2 недели.

Контроль за ходом процесса мацерации осуществляют при помощи контрольной трубки, по которой можно наблюдать за цветом жидкости в аппарате.

О завершении процесса мацерации можно судить по серо-зеленому цвету жидкости. Хорошо промыв материал можно открыть бак предварительно обеспечив достаточную вентиляцию помещения.

Мацерированный материал извлекают из бака и производят механическую очистку от гумуса периодически промывая.

После очистки от мягких тканей костные препараты (как после термической обработки, таки и после мацерации) отбеливают и дезинфицируют. Эту процедуру производят прямо в аппарате. По окончании процесса отбеливания кости промывают проточной водой, не вынимая из аппарата.

Промытые кости просушивают при комнатной температуре и после удаления влаги кости помещают в растворитель, залитый в специально для этого изготовленные емкости из нержавеющей стали с герметическими крышками.

Обезжиривание проводят в два этапа первичное и вторичное, при этом растворитель меняют на новый.

Обсуждения.

Аналогом является известный гидротермостат, предложенный доктором Механиком, состоящий из трех цилиндров различной емкости, вложенных один в другой, термометра, контрольной трубки для наблюдения за мацерационной жидкостью [5].

Недостатком этого гидротермостата является неудобство в эксплуатации и обслуживании (сложность поддержания необходимой температуры), возможность применения только на одном из этапов обработки костного материала (в процессе мацерации).

Технической задачей предлагаемого изобретения является повышение удобства в эксплуатации и обслуживания, расширение функций, возможность проводить в одном устройстве обработку костного материала на всех этапах: термообработки, мацерации, промывки, отбеливании, получая при этом прочные кости без нарушения их структуры и с естественной окраской.

гидротермостат кость мацерация

fВыводы

1. Самым дешевым и быстрым способом обработки костного материала – термохимический.

2. Данный метод позволяет значительно сократить время и улучшить качество изготовления костных и мацерированных препаратов.

3. Конструкция гидротермостата позволяет обрабатывать костный материал на всех этапах и позволяет сократить сроки изготовления костных препаратов, не нарушая их структуры, естественного цвета и сохраняя их прочность.

4. По данному методу изготовлены ряд скелетов человека разного возраста и скелетов мелких животных.

Перспективы дальнейших исследований в данном направлении. Данный метод с использованием приведенного аппарата может быть использован на кафедрах анатомии человека медицинских вузов, музеях природы, учебных заведений и т.д., требующих наличие натуральных костных анатомических препаратов.

fБиблиографический список

1. Мацерация плода / К.А. Павлов, Е.А. Дубова, Г.М. Бурдули [и др.] // Акушерство и гинекология. – 2012. – № 2. – С. 115-119.

2. Ромодановский А.В. Биотермический метод обработки костей скелета / А.В. Ромодановский // Ученые записки Омского государственного педагогического института им. А.М. Горького. Вып.12. – Омск: Ом. кн. изд-во, 1959. – С. 115-118.

3. Руководство по препарированию и изготовлению анатомических препаратов / Н.И. Гончаров, Л.С. Сперанский, А.И. Краюшкин, С.В. Дмитриенко. – Н. Новгород: НГМА, 2002. – 192 с.

4. Хрусталева И.В. Техника изготовления и хранения анатомических препаратов с основами музейного дела: метод. указание для преподавателей анатомии

Размещено на Allbest.ru

Источник: https://revolution.allbest.ru/biology/00642663_0.html

Техника приготовления гистологических препаратов. Обсуждение на LiveInternet – Российский Сервис Онлайн-Дневников

Изготовление гистологических препаратов костной ткани

Основные этапы приготовления гистологических препаратов:

1. взятие материала;

2. фиксация;

3. промывка в воде;

4. обезвоживание и уплотнение;

5. заливка;

6. приготовление срезов;

7.окрашивание;

8. заключение срезов.

Краткая характеристика этапов:

1. Взятие материала.

Для гистологического исследования берут кусочки органов и тканей величиной не более 1 см³. Материал желательно получать как можно раньше после смерти людей (метод исследования материала трупа человека — аутопсия).

С диагностической целью материал для гистологического исследования может забираться у людей прижизненно с помощью специальных инструментов или во время операций. Этот способ получения материала носит название биопсии.

2.Фиксация.

Взятый для гистологического исследования материал сразу же должен подвергаться фиксации. Фиксация – метод обработки ткани с целью закрепления ее прижизненной структуры.

Это достигается путем воздействия на ткань специальных растворов (фиксаторов). Наиболее существенным изменением, происходящим в тканях под воздействием фиксатора является процесс свертывания (коагуляции) белков.

Количество фиксатора следует брать в 20-100 раз больше объема кусочка фиксируемого материала.

Существуют фиксаторы простые и сложные. К простым относятся 10-20% раствор формалина, 96 º спирт, 100 (абсолютный) спирт, 1-2% раствор осмиевой кислоты и др. Сложные фиксаторы: спирт – формол (спирт 70º — 100 мл. и формалин 2-5 мл.

) жидкость Ценкера (сулема – 5 г, сернокислый натрий — 1 г., двухромовокиолый калий – 2,5 г, дистиллированная вода – 100 мл., ледяная уксусная кислота 5 мл.) и др.

Продолжительность фиксации – от нескольких часов до 1 суток и более в зависимости от свойств фиксатора и характера исследуемого материала.

3.Помывка в воде.

После фиксации материал промывают (чаще всего  в течение нескольких часов в проточной воде) с тем, чтобы избавить его от избытка фиксатора и различных осадков фиксирующих жидкостей.

Изучить с помощью микроскопа такие фиксированные кусочки органов невозможно, т.к. они не прозрачны. Чтобы кусочек органа можно было микроскопировать, его надо разрезать на очень тонкие пластинки – срезы, толщина которых измеряется в микрометрах. Такие срезы получают с помощью специальных приборов – микротомов.

Но для того, чтобы резать на микротоме кусочек ткани, ее надо предварительно уплотнить. Это достигается путем  пропитывания застывающими жидкостями – расплавленным парафином.

Парафин в воде не растворяется, и поэтому промытый после фиксации кусочек ткани необходимо предварительно обезводить,  и только затем пропитывать.

4. Обезвоживание.

Обезвоживание ткани производятся постепенно (чтобы не произошло сморщивания) путем проведения ее через спирты возрастающей крепости: 50º, 60º, 70º, 80º, 90º, 96º, 100º.  В каждом спирте кусочки находятся от нескольких часов до 1 суток в зависимости от величины кусочка.

5.Уплотнение (заливка).

При заливке кусочки предварительно пропитываются теми жидкостями, которые служат растворителями для парафина (ксилол или толуол). Заливка в парафин. При заливке в парафин кусочки из абсолютного спирта

переносятся в смесь абсолютного спирта с хлороформом или ксилолом, взятых поровну, затем чистый ксилол и, наконец, в расплавленный насыщенный раствор парафина в хлороформе, где они находятся в термостате при температуре 37º  до 1 суток и более. Дальнейшая  заливка проводится в термостате при температуре 54º -56º в трех порциях парафина.

Окончательная заливка проводится в парафин с добавлением воска, который наливают в специальные бумажные коробочки или стеклянные чашки, а затем эти коробочки или чашки после появления на поверхности парафина пленки, погружают в воду.

Происходит полное затвердение парафина. Кусочки с окружающим их парафином извлекают из коробочек и с помощью расплавленного парафина, наклеивают на деревянные кубики, получаются парафиновые блоки.

Уплотнения также можно добиться  замораживанием кусочка органа (срочная биопсия).

6. Приготовление срезов.

Срезы с блоков изготовляются на микротоме. Наиболее распространены микротомы санный и замораживающий. В специальных устройствах микротома зажимается парафиновый блок и микротомный нож.

Существует механизм, поднимающий объектодержатель с блоком на заданное количество микрометров.

Это позволяет при каждом скольжении ножа в плоскости параллельной поверхности блока получать срезы толщиной 5-10 микрометров с парафиновых блоков.

7. Окрашивание.

Изготовленные на микротоме срезы окрашиваются. Перед окраской из парафиновых срезов обязательно удаляют парафин (растворением в ксилоле).

Окрашивание необходимо производить для  того, чтобы отчетливо выявить под микроскопом тонкие структуры объекта. В неокрашенных срезах большинство структур одинаково преломляет свет, поэтому рассмотреть их не удается.

Выявление на срезе гистологических структур основано на неодинаковом их отношении к красителям. Одни структуры среза вступают в реакцию с кислыми  красителями и ими окрашиваются (ацидофильные, оксифильные структуры),  другие реагируют с основными красителями и окрашиваются преимущественно  ими (базофильные структуры). Некоторые структуры окрашиваются и кислыми и основными красителями.

По происхождению различают краски естественные, к которым относятся краски растительного и животного происхождения, и краски искусственные.

Краской растительного происхождения является гематоксилин, который добывается из кампешевого  дерева, растущего в Америке и  в Армении.

К краскам животного происхождения относится кармин, который добывается из насекомых кошенили, живущих на кактусовых деревьях в Мексике, Армении и др. В  настоящее время большинство красок готовят синтетически(искусственные  краски).

По окрашиванию определенных гистологических структур различают краски ядерные (окрашивание ядра), цитоплазматические  (окрашивающие цитоплазму), и специальные, окрашивающие избирательно определенные структуры.

Ядерные краски – гематоксилин, кармин, сафранин, метиленовая синь, азур, тионин. Цитоплазматические краски – эозин, пикрофуксин.

Существуют специальные краски и реактивы: судан Ш (окрашивает жир в  оранжевый цвет), осмиевая кислота (импрегнируемый ею жир окрашиватся в черный цвет), резорцинфуксин Вейгерта (дает темно-синюю окраску эластических волокон), орсеин (окрашивает эластические волокна в бурый цвет). Метиленовый синий окрашивает нервные элементы в синий цвет, а при импрегнации серебром они приобретают коричневый цвет.

Чаще всего для окрашивания гистологических срезов применяется окрашивание  раствором гематоксилина (приготовленным по методу Бемера) и 1-2%  эозином.

8. Заключение среза.

Окрашенные и промытые в воде срезы во избежание помутнения обезвоживают в спиртах (70º, 96º),  просветляют в карбол-ксилоле, ксилоле, а затем  на предметное стекло, где находится срез, помещают каплю бальзама  и срез накрывают покровным стеклом. Бальзам представляет собой  растворенную в ксилоле смолу одного из видов сосны, растущей в Канаде (канадский бальзам),  смолу пихты (сибирский бальзам) или специальную синтетическую среду.

При исследовании биопсий с целью уточнения диагноза в гистологических лабораториях прибегают к ускоренной обработке материала. Кусочки тканей и органов при этом проходят те же этапы обработки, но за 5-7 дней.

Иногда производится так называемая срочная биопсия, когда в течение 15-80 мин. материал фиксирует, получают срезы, окрашивают их и заключают. Быструю фиксацию производят в 10% формалине, подогреваемом пламенем горелки или с использованием СВЧ-печи.

Уплотнения добиваются замораживанием (хлорэтилом, углекислотой или с помощью замораживающего микротома).

Источник: https://www.liveinternet.ru/users/tufelka/post424314108

Техника изготовления гистологических препаратов -ЧИТАЛЬНЫЙ ЗАЛ

Изготовление гистологических препаратов костной ткани

Изготовление гистологических препаратов включает: 1) фиксацию материала; 2) приготовление гистологических срезов; 3) окрашивание срезов.

Фиксация материала

Общие сведения. Сущность фиксации заключается в том, чтобы сохранить взятые кусочки органов и тканей от гниения и ферментативных процессов, изменяющих структуру тканей.

Фиксируемые ткани претерпевают ряд физико-химических изменений. Наиболее существенными из них являются: быстрое свертывание белков и отчасти липоидов и переход их в такое состояние, при котором ткани не изменяются от длительного хранения и во время последующих обработок.

Фиксацию тканей производят в жидкостях различного состава. Наиболее употребляемыми являются формалин, спирт, реже ацетон, сулема и др.

Фиксация формалином. Продажный формалин (40%-ный водный раствор формальдегида) применяется в 10%-ном, 15%-ном растворе (10,0—15,0 продажного формалина на 90,0—85,0 воды). Формалин в указанной концентрации сравнительно быстро (48— 72 ч) пропитывает ткань и хорошо фиксирует ее.

Нельзя фиксировать материал в растворе формалина более высокой концентрации или в неразведенном продажном формалине.

В этом случае поверхностные слои ткани быстро уплотняются, образуют корочку, которая препятствует проникновению фиксирующей жидкости вглубь, где процессы аутолиза могут продолжаться.

В связи с тем, что в формалине всегда содержится какое-то количество муравьиной кислоты, которая может оказать отрицательное воздействие на ткань и помешать некоторым методам дальнейшей обработки материала (серебрение и др.) его следует нейтрализовать мелом. На 100 г продажного формалина (40%-ный раствор формальдегида) прибавляют Юг мела.

Содержимое несколько раз взбалтывают, затем дают отстояться, пока мел осядет на дно посуды. Следует также иметь в виду, что при хранении формалина в холодном помещении формальдегид способен к .полимеризации и выпадению из крепких растворов в виде белых осадков.

В целях предупреждения этого рекомендуют хранить формалин в теплом помещении, в темной посуде.

Кусочки ткани, взятые для гистологического исследования, не должны быть толще 0,5—0,7 см. Чтобы кусочки ткани не прилегали плотно к стенкам банки, их кладут на вату или фильтровальную бумагу.

Объем фиксирующей жидкости должен превышать примерно в 10 раз объем взятого материала.

Фиксация водным раствором формалина нежелательна в тех случаях, когда исследование ткани имеет целью обнаружение веществ, растворимых в воде.

В случаях, когда требуется быстрое исследование, кусочки ткани фиксируют в формалине, нагретом до 85—90° С. Продолжительность фиксации кусочков толщиной 2—3 мм при такой температуре 10—15мин.

При длительном хранении материала; в формалине в фиксируемой ткани образуются темно-бурые осадки, которые загрязняют препараты.

Для удаления осадков рекомендуется опускать гистологические срезы в 2—3%-ный раствор перекиси водорода или в 1%-ный раствор едкого кали, затем их несколько раз промывать водой.

Фиксация спиртом. Этот метод целесообразен только в тех случаях, кргда необходимо зафиксировать в тканях вещества, растворимые в воде и водных растворах фиксаторов. Для фиксации применяют спирт 95 или 100°.

Спирт, извлекая воду из кусочков ткани, сам разбавляется и делается менее крепким. Поэтому рекомендуется менять спирт несколько раз. Кусочки ткани при фиксации спиртом должны быть толщиной 2—3 мм.

В зимнее время рекомендуется применять спирт-формалин (спирта 70°—90,0, формалина 10,0).

ПРИГОТОВЛЕНИЕ ГИСТОЛОГИЧЕСКИХ СРЕЗОВ

Общие сведения. Для изготовления гистологических срезов фиксированная ткань нуждается в дополнительном уплотнении. Для этого существует несколько методов: замораживание ткани, пропитывание ее целлоидином, парафином и т. п.

После фиксации и уплотнения ткани тем или иным способом приготовляют срезы. Для получения тонких

Срезов одинаковой толщины, годных для макроскопического исследования, пользуются особыми аппаратами микротомами. Их существует несколько типов. Наиболее употребительными являются замораживающие и санные микротомы (рис. 137). Принцип устройства их состоит в том, что после каждого среза столик, к которому прикреплена исследуемая ткань, поднимается на заданную высоту.

Таким образом, срезы получаются одинаковой толщины. Срез должен быть достаточно тонким и прозрачным, обычно изготовляют срезы толщиной от 4 до 15 м>км. Замораживание ткани.

При изготовлении гистологических препаратов ткань замораживают на замораживающем микротоме, применяя жидкую углекислоту, эфир, хлорэтилен, или с помощью электрического тока на столике из полупроводников.

Путем замораживания ткани удается довольно быстро изготовить гистологические препараты. Этот метод используется также при исследовании тканей на отложение в них жира и жиросодержащих веществ, поскольку жиры растворяются в спиртах, ксилоле и ацетоне.

Заливка ткани в целлоидин. Для заливки препаратов в целлоидин вырезают кусочки ткани толщиной 1—3 мм и последовательно проводят через спирты возрастающей крепости — 50, 75, 95 и 100°, выдерживая по 24 ч в каждом.

Через спирт крепостью 100° кусочки ткани рекомендуется проводить дважды, выдерживая по 24 ч каждый раз. Затем кусочки ткани переносят в смесь равных частей абсолютного (100°) спирта и эфира также на 24 ч.

После этого кусочки ткани помещают вначале в 2%-ный, а потом 8%-ный раствор целлоидина на 2—3 дня в каждый.

Целлоидин готовят из кино — или фотопленки. Вначале ее отмывают от желатины в горячей воде, затем просушивают, мелко нарезают и растворяют в смеси из равных частей спирта и эфира. 2%-ный раствор целлоидина по консистенции сходен с жидким коллодием, а 8%-ный напоминает густой сироп.

После выдержки в густом целлоидине кусочки ткани заливают этим же целлоидином в чашечке под колпаком, где он уплотняется в течение 12—24 ч. Когда целлоидин приобретет плотность эластичной резины, вырезают блоки и наклеивают их целлоидином на квадратные деревянные кубики. Можно заливать кусочки ткани целлоидином непосредственно на кубиках.

Влоки необходимо маркировать, для чего на одной из боковых поверхностей кубика делают тушью соответствующее обозначение. Обычно пишут номер исследования.

Хранят кусочки, залитые в целлоидин, в 70° спирте. Заливка ткани в парафин. Обезвоживание ткани производят в спиртах восходящей крепости в том же порядке, как и при; целлоидиновой проводке.

После выдержки кусочков исследуемой ткани в 100° спирте их переносят в смесь равных частей абсолютного спирта и ксилола на 2—3 ч. Затем кусочки ткани заливают чистым ксилолом и выдерживают в течение 2 — 3 ч.

По истечении указанного срока их переносят в новый чистый ксилол на 2—3 ч, потом в парафин-ксилол (насыщенный раствор парафина в ксилоле при 30° С) на 1 —1,5 ч. После этого кусочки ткани помещают в чистый; парафин при температуре 54— 56° С на 1,5—2 ч.

Затем их заливают парафином в бумажные или металлические формочки и охлаждают в воде. Уплотненные кусочки ткани, так же как и целлоидиновые блоки, наклеивают на деревянные кубики и маркируют.

ОКРАШИВАНИЕ СРЕЗОВ

Общие сведения. Окраска гистологических срезов основана на неодинаковом сродстве тканевых элементов к определенным красителям. Ядра клеток более способны окрашиваться основными, а цитоплазма — кислыми красками. Соответственно этому различают основные, или ядерные, и кислые, или диффузные, краски.

Наиболее часто в обычной ветеринарной патологоанатомической практике применяются окраски срезов гематоксилин-эозином по Ван-Гизону, Перлсу, Суданом III и др.

Окраска гематоксилин-эозином. Окрашивают срезы в маленьких чашках Петри или на стеклах. Этот метод применяется для окраски срезов, приготовленных любым способом.

При этом ядра клеток приобретают фиолетово-синий или густо-синий цвет, а цитоплазма и волокнистое вещество — светло-синий или розово-красный. Жиры и липоиды не окрашиваются.

Эритроциты млекопитающих, поскольку они ядер не содержат, окрашиваются только эозином.

Окраску срезов в чашках Петри производят следующим образом.

1. Срез переносят препаровальной иглой из воды в раствор гематоксилина на 2—5 мин.

2. Промывают в воде 2—5 мин.

3. Погружают на 10—20 с в 1%-ный раствор соляной кислоты на 70° спирте (если срез сильно перекрашен гематоксилином, его следует держать в этом растворе несколько дольше).

4. Промывают в чистой воде 5—10 мин.

5. Промывают в слабощелочном растворе (в баночку с водой прибавляют 1—2 капли нашатырного спирта) 10 мин.

6. Промывают снова чистой водой в течение 10— 15 мин. Если срез после щелочной воды недостаточно промыт, он плохо опрашивается эозином.

7. Окрашивают эозином в течение 3—5 мин.

8. Промывают в течение 1—2 мин водой. 280

9. Обезвоживают в спиртах восходящей крепости— 75, 90, 100°. Если срез перекрашен эозином, его следует несколько дольше держать в 75° спирте.

10. Просветляют в карболксилоле.

11. При помощи шпателя и иголки срез переносят на предметное стекло.

12. Высушивают фильтровальной бумагой.

13. На срез наносят каплю канадского или пихтового бальзама и накрывают покровным стеклом.

Окраска по Ван-Гизону. В срезах, окрашенных по Ван-Гизону, соединительная ткань красится в ярко-красный, остальные ткани — в желтый или серовато-желтый цвет. Ядра окрашиваются в черный или тёмно-фиолетовый цвет.

Окраску производят следующим образом.

1. Срезы интенсивно окрашивают гематоксилином (лучше гематоксилин Вейгерта) и споласкивают в воде.

2. Сразу переносят в пикрофуксин на 3—5 мин (смесь насыщенного водного раствора пикриновой кислоты—150,0 и насыщенного водного раствора кислого фуксина — 3,0—5,0).

3. Быстро промывают в воде (вода извлекает из среза фуксин).

4. Обезвоживают 95° спиртом 1—2 мин.

5. Просветляют в карболксилоле и заключают в пихтовый бальзам, как при окраске гематоксилин-эозином.

Окраска Суданом III. Судан III — нейтральная азокраска, растворимая в спирте, ацетоне и жирах, не растворимая в воде. Окраску Суданом III производят для определения в срезах жиров и липидов. Техника окраски следующая.

1. Замороженные срезы переносят изводы на 0,5— 1 мин в 50° спирт.

2. Срезы помещают в свежефильтрованный раствор Судана на 10—20 мин.

3. Споласкивают 50° спиртом в течение 0,5—1 мин.

4. Тщательно промывают водой в течение 10 — 15 мин.

5. Срезы подкрашивают квасцовым гематоксилином Эрлиха или Бемера.

6. Промывают водой в течение 3—5 мин. Перекрашенные в гематоксилине срезы дифференцируют

В 1%-ном водном растворе соляной кислоты, споласкивают подщелоченной водой, затем чистой водой.

7. Заключают в глицерин или глицерин-желатину.

8. Накрывают покровным стеклом. Окраска по Перлсу. Этот способ окраски применяют для выявления в тканях гемосидерина.

1. Из дистиллированной воды срезы переносят стеклянными иглами на 15—20 мин в свежеприготовленную смесь, состоящую из одной части 2%-ного раствора желтой кровяной соли и полутора частей 1%-ного водного раствора соляной кислоты.

2. Промывают дистиллированной водой в течение 5—10 мин.

3. Докрашивают квасцовым кармином 15—20 мин.

4. Ополаскивают в воде и проводят через спирты, карболксилол и бальзам.

Железосодержащий пигмент — гемосидерин — приобретает синевато-зеленоватый или голубоватый цвет.

Окраска по Туревичу. По способу Туревича окрашивают срезы, изготовленные из мозга, для диагностики бешенства. При этом тельца Бабеша — Негри и эритроциты окрашиваются фуксином в красный цвет, нервные клетки гематоксилином — в синий.

Для гистологического исследования берут кусочки аммонова рога и мозжечка, фиксируют их в 10%-ном формалине, ацетоне или жидкости Адуцкевича следующего состава: 80%-ной уксусной кислоты — 1 часть, хлороформа —2 части, 96° этилового спирта — б частей.

Продолжительность фиксации при комнатной температуре в формалине 1 сут, в ацетоне и жидкости Адуцкевича — 3—6 ч. После фиксации вырезают кусочки толщиной не более 1 —1,5 мм, заливают в парафин, после чего готовят гистологические срезы, высушивают и окрашивают.

Окраску по Туревичу производят следующим образом.

1. Срезы перед окраской депарафинируют в ксилоле 10—20 мин.

2. Смывают спиртом.

3. Окрашивают ядра клеток гематоксилином Вей-герта в течение 2 мин.

4. Срезы промывают водой.

5. Дополнительно окрашивают 1 % — ным раствором

Кислого фуксина в течение 1 мин.

6. Промывают водой.

7. Дифференцируют в смеси 95° спирта и насыщенного водного раствора пикриновой кислоты в течение 10—20 с до ясно-желтого оттенка.

8. Высушивают фильтровальной бумагой.

9. Обезвоживают абсолютным спиртом.

10. Просветляют в ксилоле в течение 1 мин.

11. Заключают в канадский, или пихтовый, бальзам.

Рис. 137. Общий вид замораживающего микротома:/ — шланг для подачи углекислоты;2—- столик; 3 — нож.

Источник: http://chitalky.ru/?p=4958

Гистологическое исследование биопсийного материала костей + декальцинация (и хрящевой ткани)

Изготовление гистологических препаратов костной ткани
Гистологическое исследование биопсийного материала костей + декальцинация (и хрящевой ткани) — это исследование тканей под микроскопом. Гистологическое исследование является самым важным в диагностике злокачественных опухолей, одним из методов оценки лекарственного лечения.

С помощью специальных растворов (гистологической проводки) кусочек ткани обезвоживают и делают жирорастворимым для последующей пропитки парафином в специальных формах, которые при комнатной температуре представляют собой твёрдые кубики. Костные образования и фрагменты костей предварительно декальцинируют.

С помощью микротома с вмонтированным очень острым ножом, который может снимать слои толщиной от 3 микрометров, выполняют срезы.

В последующем, срезы монтируют на стекло и проводят их подготовку для окраски (для различных окрасок методики подготовки могут различаться, но в большинстве случаев, из срезов удаляют весь парафин вместе с остальными жирами и пропитывают этанолом, чтобы сделать возможным диффузию водорастворимых веществ).

И только после этого производят окраску различными красителями, что позволяет сделать видимым под микроскопом клетки и их элементы, а также различные элементы межклеточного вещества тканей. Для качественного исследования необходимо правильно оформлять направление на гистологическое исследование.

Заполнять все указанные в направлении пункты с точным указанием места локализации взятого материала, его связь с окружающими тканями, обязательно указывать основные клинические проявления и давность процесса. Стандартный бланк направления на патогистологическое исследование заполняет и подписывает лечащий врач.

При этом в направлении отражают такие клинические данные, как продолжительность заболевания, характер проведённого лечения, результаты предыдущих исследований, если они проводились. При наличии опухоли необходимо указать её точную локализацию, темпы роста, размеры, консистенцию, отношение к окружающим тканям, наличие метастазов и других опухолевых узлов, специальное лечение и клинический диагноз. Если в направлении отсутствуют необходимые данные, заведующий патологоанатомическим отделением ставит об этом в известность заведующего того отделения, откуда была прислана биопсия, а при повторных случаях сообщает администрации.

Показания

Морфологические исследования костных образований, фрагментов костей и хрящевой ткани проводятся с целью диагностики злокачественных опухолей или инфекции кости, установления или подтверждения клинического диагноза заболевания и его осложнений, определения обоснованности и эффективности проводимых лечебных мероприятий.

Подготовка

Условия подготовки определяются лечащим врачом. Материал, подлежащий гистологическому исследованию, тотчас по иссечении помещается для фиксации в банку с 10% раствором нейтрального формалина. Объём фиксирующей жидкости должен в 10 раз превышать объём фиксируемого материала. На посуде с материалом должна быть наклейка с фамилией и инициалами больного и местом взятия материала. Помещать в одну посуду несколько объектов исследования, взятых из различных мест и от разных больных, не разрешается. На каждый направляемый для гистологического исследования материал, лично врачом, производившим взятие материала, заполняется бланк направления. В направлении после паспортных данных указывается дата, количество объектов исследования, откуда получен материал, его характеристика, предполагаемый клинический диагноз, особенности клинической картины болезни, цель исследования. При исследовании костей и суставов предоставляются рентгенограммы, томограммы и т.д. Во всех случаях приводятся сведения об основных проведённых лечебных мероприятиях, их сроках и дозах, особенно о применении сильнодействующих препаратов (цитостатики, гормоны), специфической и лучевой терапии. В случае если больному ранее уже проводилось гистологическое исследование, лечащий врач должен указать в направлении дату первичного исследования, его номер, учреждение, в котором оно производилось, и гистологический диагноз (заключение). Целесообразно вместе с направлением предоставить патологоанатому и гистологические препараты проводившихся ранее исследований. Костные образования и фрагменты костей категорически запрещается без участия патологоанатома делить на части и посылать в различные патологоанатомические учреждения, так как при исследовании неравнозначного материала могут быть даны противоречивые заключения.

Интерпретация результатов

Гистологическое заключение даётся в соответствии с последними гистологическими классификациями ВОЗ и медицинской номенклатурой принятой у нас в стране.

На основании данных сопроводительных документов и результатов исследования микроскопических препаратов, врач-патоморфолог составляет заключение, содержащее развёрнутое описание выявленных морфологических изменений и вытекающий из него морфологический диагноз патологического процесса (заболевания). Если по результатам исследования диагноз поставить не представляется возможным (недостаточный объём объекта исследования, незначительная выраженность или малая специфичность обнаруженных изменений и т.п.), в заключении описывается только микроскопическая картина объекта исследования.

Источник: https://dnkom.ru/analizy-i-tseny/gistologicheskie-analizy/gistologicheskoe-issledovanie-biopsiynogo-materiala-kostey-dekaltsinatsiya-i-khryashchevoy-tkani/

Лечение Костей
Добавить комментарий