Выделение днк из костной ткани

К вопросу о выделении геномной днк из содержимого костного канала фрагментов трубчатых костей

Выделение днк из костной ткани

г. Барнаул

Тема экстракции геномной ДНК из костной ткани в практике судебно-медицинской экспертизы вещественных доказательств в последнее время становится всё более актуальной.

В процессе выделения ДНК из биологического материала основная задача – хорошо диспергировать ткань, чтобы разрушить клетки, а затем отделить ДНК от сопутствующих ей белков и посторонних примесей для получения препарата с чистотой, пригодной для постановки ПЦР.

С мягкими тканями в большинстве случаев проблем не возникает, а вот выделение ДНК из кости гораздо более трудоемко и требует специальных подходов.

Общепринятая методика получения ДНК из костной ткани предполагает очень длительный (в течение нескольких дней) процесс пробоподготовки, декальцификации и очистки ДНК с использованием фенол-хлороформной экстракции.

К недостаткам метода нужно отнести очень высокую токсичность (использование в процессе выделения агрессивных органических соединений). Он довольно трудоемок, при этом возможны значительные потери ДНК, остаточные загрязнения протеинами, фенолом и хлороформом – сильными ингибиторами ПЦР.

В конечном итоге в большинстве случаев приходится сталкиваться с проблемой нестабильности конечного результата – результаты либо отрицательные, либо труднотрактуемые.

С целью поиска альтернативных методов выделения, нами была использована методика исследования содержимого костного канала фрагментов трубчатых костей в качестве биологического материала для выделения геномной ДНК из кости. Мы испытывали различные варианты нефенольных методов выделения ДНК:

  • метод с использованием ионообменной смолы Chelex 100. Процедура заключается в очистке ДНК от металлосодержащих соединений и протеинов путем кипячения в присутствии Chelex 100, затем супернатант непосредственно добавляют в ПЦР-смесь;
  • метод с использованием набора реагентов DiatomTM DNA Prep 200 (Москва), основанного на использовании лизирующего реагента с гуанидинтиоцианатом, который предназначен для лизиса клеток, солюбилизации клеточного дебриса, а также для денатурации клеточных нуклеаз. В присутствии лизирующего реагента ДНК активно сорбируется на носителе NucleoSTM, с которого она легко снимается с помощью элюирующего буфера;
  • метод с использованием набора реагентов Diamond DNA Genomic DNA Extraction Kit for Animal Tissue Samples, в состав лизис-буфера которого входят компоненты предотвращающие адсорбцию ДНК на стенках пробирки, ее окисление и эффективно связывающие полифенолы. ДНК остается в растворе, а адсорбция примесей, ингибирующих ПЦР происходит с помощью сорбента, частицы которого имеют нанометровые размеры и не взаимодействуют с ДНК, что предотвращает ее механическую и химическую деградацию. Дополнительная очистка ДНК от белков, полисахаридов и компонентов лизис-буфера происходит вследствие селективного осаждения молекул ДНК высокоэффективным осадителем.

Сравнительный анализ преимуществ и недостатков этих методов проводился с учетом: способности ДНК к амплификации; сохраняемости проб выделенной ДНК; длительности и трудоемкости процедуры пробоподготовки и экстрагирования; необходимости использования токсических веществ; материальных затрат.

Исследовались кости от трупов, находящиеся в архиве нашего отделения, причина смерти которых не установлена из-за гнилостных изменений, промерзания и обгорания.

Исследуемый материал готовился следующим образом: делались соскобы с внутренней поверхности трубчатых костей, содержимое высушивалось на отрезке марлевого бинта.

Выделение хромосомной ДНК проводилось с использованием трех вышеуказанных методик.

Амплификацию изучаемых полиморфных последовательностей ДНК методом ПЦР проводили в монолокусном формате, продукты полимеразной цепной реакции фракционировали электрофоретически в 8% ПААГ в денатурирующих условиях и анализировали в проходящем свете после окрашивания нитратом серебра с использованием коммерческих наборов НПФ “АТГ-Биотех” Москва. При этом были получены положительные результаты. В качестве примеров приводим 4 наблюдения.

Наблюдение 1: 03.07.2010г.

в результате взрыва на военном полигоне произошла гибель двух и более лиц, в отделение были доставлены три фрагмента бедренной кости от человеческих останков, наружная поверхность которых сильно обуглена, с наложениями вещества черного цвета, а содержимое костных каналов желтого и красновато-серого цвета. В результате исследования получены препараты ДНК мужской половой принадлежности, пригодные для идентификационного анализа (см. рис. 1).

Рис. 1. Электрофореграмма амплифицированных фрагментов ДНК локуса Амелогенина содержимого костных каналов трех фрагментов бедренной кости от человеческих останков при взрыве на военном полигоне, выделенных: с использованием Chelex 100 – дорожки 1, 2, 3; набором реагентов Diamond DNA – дорожки 4, 5, 6 (соответственно).

Наблюдение 2: 09.04.2010г. в отделение доставлен фрагмент бедренной кости от трупа неустановленного мужчины, погибшего при пожаре.

Источник: http://journal.forens-lit.ru/node/494

О трудностях получения древней днк. фрагмент из книги сванте пэабо «неандерталец» – антропогенез.ру

Выделение днк из костной ткани

Свою текущую научную задачу я видел в том, чтобы выработать систематический подход и надежные методики секвенирования древней ДНК. Еще в Беркли я начал понимать, насколько серьезна проблема внесения инородной современной ДНК в материалы с ископаемой ДНК, особенно когда применяется ПЦР.

С использованием новых секвенаторов и термоустойчивой ДНК-полимеразы процесс могли запустить всего несколько молекул ДНК или даже одна-единственная молекула.

Если, к примеру, музейный экспонат растерял все свои собственные древние ДНК, зато приобрел за время хранения несколько фрагментов ДНК музейного куратора, то мы в результате вместо древнеегипетского жреца изучали бы музейного куратора.

С вымершими животными в этом отношении было проще, меньше возможности перепутать нуклеотидные последовательности. На самом деле, именно работая с животными, я осознал, насколько серьезна проблема внесения инородной ДНК: иногда, умножая мтДНК из остатков древних животных, я получал человеческую нуклеотидную последовательность.

В 1989 году, еще до отъезда в Мюнхен, я опубликовал статью в соавторстве с Аланом Уилсоном и Расселом Хигучи (тем, который начал работы с кваггой). Статья ввела в обиход “критерии аутентичности”, как мы их назвали, то есть ряд процедур, которые необходимо выполнить, чтобы подтвердить “древность” прочтенной ДНК1.

Мы предложили параллельно с исследуемым материалом каждый раз проводить реакцию с “чистым экстрактом”, то есть использовать все те же реагенты, но без добавления ископаемого образца. Таким образом выявлялись фрагменты ДНК, случайно попавшие в сами реагенты.

Кроме того, и процесс выделения ДНК, и ПЦР предлагалось провести несколько раз — требовалось, чтобы искомая цепочка ДНК появилась хотя бы дважды. И наконец, я пришел к окончательному заключению, что древние фрагменты ДНК вряд ли бывают длиннее 150 нуклеотидов. В общем, вывод из всего этого напрашивался неутешительный: все прошлые эксперименты, притязающие на выделение древних ДНК, особенно до изобретения ПЦР, были безнадежно наивными.

Да и мои собственные результаты, те найденные ДНК-последовательности мумий, опубликованные в 1985 году, задним числом выглядели подозрительно длинными: ведь ДНК всегда разбивается на короткие фрагменты. Как показали другие исследователи, я выделил гены антигенов, трансплантационных белков2.

Я мог бы назвать две возможные причины их появления в составленной тогда цепочке (а мы как раз их и изучали в тот момент в лаборатории в Упсале): либо я пользовался реагентами, предназначенными для антигенов, либо фрагмент ДНК случайно попал в исследуемый материал. Учитывая длину полученной цепочки, я склоняюсь ко второму варианту.

Я утешал себя мыслью, что вот таким образом я поучаствовал в научном прогрессе: методики устаревают, на их место приходят новые, лучшие. И я рад, что к этой части прогресса я буквально приложил собственные руки. К тому же с неожиданной стороны пришла помощь.

В 1993 году Томас Линдаль опубликовал короткие комментарии в Nature, где предлагал критерии, схожие с опубликованными нами в 1989- м3. Соблюдать их он считал необходимым, если дело касалось древних ДНК4. Хорошо, что такой уважаемый ученый из другой области подтвердил наши выводы — я уже тогда обеспокоился тем, кто приходит в область исследований древней ДНК.

Громкое освещение в прессе и общественное внимание привлекали ученых без достаточных знаний по биохимии и молекулярной биологии; они просто отправляли на ПЦР любые древние образцы, оказавшиеся под рукой. Мы в лаборатории называли такой подход нелицензионной молекулярной биологией”.

Из всех возможных лабораторных проектов сам я склонялся к изучению истории человека методами молекулярной биологии. Это замечательно интересная область знаний, хотя и пестрящая домыслами и предубеждениями, взятыми напрокат из отживших идей.

Мне хотелось привнести стройность в науку о человеческой истории и сделать это на основе изучения ДНК древних людей. Для этого можно было бы начать с очевидного: в качестве исходного материала взять сохранные останки человека бронзового века из торфяников Северной Германии и Дании.

Но чем больше я про них читал, тем лучше понимал, что сохранились остатки благодаря высокой кислотности среды, дававшей дубильный эффект. Кислая среда ведет к потере нуклеотидов и разрывам нуклеотидных последовательностей, что, по понятным причинам, сохранению ДНК никак не способствует.

Но, что еще хуже, сам факт, что человеческие ДНК находят при лабораторных исследованиях даже в остатках животных, показывает, насколько непросто работать с остатками человеческими.

Обдумав все это, мы начали с образцов вымерших животных, таких как сибирский мамонт. Мы запустили планомерные эксперименты с контролями.

Например, мои студенты Олива Хандт и Матиас Хёсс проводили опыты с использованием праймеров, специфичных для человеческой мтДНК.

Я пришел в смятение, когда они уверенно выделили человеческую ДНК не только из животных образцов, но и из контрольных вытяжек, вообще без добавок. Мы повторили эксперимент с новыми реагентами, “свежедоставленными” в лабораторию, но результат был тот же.

И еще раз, и еще, и еще, месяц за месяцем — человеческая ДНК присутствовала везде и всюду. Меня охватило отчаяние.

Чему верить? И как вообще доверять результатам, если только они полностью не совпадут с ожидаемыми (например, у сумчатого волка ДНК-последовательность соответствует сумчатым)? А если доверять только ожидаемым результатам, то зачем вообще работать в этой области? Мы же никогда не откроем ничего неожиданного, того, ради чего и существуют настоящая наука и настоящий эксперимент.

Каждый день я уходил домой разочарованный и измотанный постоянными провалами. Но постепенно я стал понимать, насколько легкомысленно относился к проблеме занесенных загрязнений. Очевидный логический вывод, следующий из чрезвычайной чувствительности ПЦР, мне в голову почему-то не пришел.

И в Беркли, и в первые месяцы в Мюнхене мы экстрагировали ДНК из музейных образцов, работая на общих лабораторных столах, где в обращении было огромное число ДНК и человека, и разных других исследуемых организмов. Даже если мельчайшее количество современной ДНК попадет в раствор, содержащий экстракт ископаемой ДНК, современная ДНК возьмет верх над древним материалом.

Такое запросто могло произойти, даже если мы всего лишь забыли поменять пластиковую насадку на пипетке.

Стало понятно, что нам придется полностью отделить — причем отделить физически — работы с древними ДНК от всех остальных лабораторных проектов. В особенности стоило обратить внимание на изоляцию ПЦР, при которой получались триллионы молекул.

Нам нужна была лаборатория, которая занималась бы исключительно выделением и амплификацией древнего материала.

На нашем этаже нашлась маленькая комнатка без окон, мы ее полностью вычистили и покрасили, затем задумались, как бы избавиться от тех ДНК, что неминуемо проникли в лабораторию с новыми столами и инструментами.

Меры мы приняли самые жесткие. Абсолютно все в лаборатории было вымыто хлоркой, которая окисляет ДНК. К потолку приделали ультрафиолетовые лампы, их включали на ночь, так как  ультрафиолет разрушает молекулы ДНК.

Мы купили новые реагенты — и первая в мире “чистая” лаборатория для исследования древнего материала заработала (рис. 4.1). И все сразу поменялось. Наши контрольные растворы перестали выдавать ДНК, как им и полагалось. А из рабочих растворов, как и полагалось, определялась ДНК.

Но мало-помалу, спустя несколько месяцев, в контроле опять стали появляться ДНК. Я рвал и метал. Ну что опять?! Мы выбросили все реагенты и закупили новые.

И опять ситуация исправилась, но ненадолго. Я прямо-таки с ума сходил на почве “чистоты в чистой комнате”, а еще мы установили изуверские правила работы в “чистой комнате”, и эти правила действуют и соблюдаются до сих пор.

Во-первых, доступ в комнату был открыт только тем, кто непосредственно проводил эксперимент, в нашем случае только Матиасу и Оливе. Перед тем как войти, они облачались в специальные халаты, шапочки, бахилы, надевали перчатки и закрывали лицо щитком.

Еще несколько тщетных экспериментов — и у нас добавилось новое правило: входить в комнату можно только утром непосредственно из дому. Если им приходилось пройти через помещения, где содержались продукты ПЦР, вход в “чистую комнату” на весь день им был закрыт.

Все химикаты поступали прямо в “чистую комнату”, мы купили новое оборудование, которое тоже привезли прямо туда. Постепенно ситуация улучшалась. И все равно новые реагенты обязательно тестировались на присутствие человеческой ДНК, и не однажды целую партию отправляли обратно.

Матиаса и Оливу оставалось только пожалеть: они-то рассчитывали позаниматься ДНК древних людей и вымерших животных, а вместо этого попали в кабалу утомительных процедур, по сто раз перепроверяли реагенты и волновались, как бы не занести лишней ДНК.

В конце концов наши усилия начали приносить плоды, и общее настроение поднялось. До сих пор мы исследовали мягкие ткани, кожные или мышечные. Но я вспомнил, как в Упсале успешно вытягивал ДНК из хрящей мумий, то есть из ткани, похожей на костную.

Если бы удалось выделить ДНК из древних костей, а не из мягких тканей, то перед нами открылось бы множество новых возможностей, так как от древних людей остаются в основном кости. В 1991 году Эрика Хагельберг и Дж.Б. Клегг из Оксфордского университета опубликовали статью с описанием процесса выделения ДНК из костей древних людей и животных5.

Поэтому, взяв наконец под контроль инородные загрязнения, Матиас занялся освоением технологий выделения ДНК из костей древних животных. В этом случае вероятность перепутать целевую ДНК с загрязнениями значительно уменьшалась: ведь с животными мы почти не работали.

Один из таких методов, описанных в литературе, предлагал протокол для экстрагирования ДНК микроорганизмов. Основан он на том, что ДНК в условиях солевого раствора высокой концентрации связывается с кремниевыми микрочастицами — в данном случае с тончайшей стеклянной пылью.

Затем кремниевые частицы тщательно отмываются, чтобы избавиться от всех нежелательных компонентов, которые могут вмешаться в ПЦР. И после этого молекулы ДНК отделяют от кремниевых частиц методом понижения концентрации соли. Конечно, процесс экстрагирования ДНК оказался весьма громоздким, но он работал и приносил результаты.

Паабо С. Неандерталец (перевод Е. Наймарк). Издательство Corpus. Москва, 2018.  С. 82-88.

Книга на сайте издательства

Источник: http://antropogenez.ru/article/1058/

Выделение ДНК

Выделение днк из костной ткани

Одними из наиболее интересных и значимых исследований, проводимых в АНО «Судебный эксперт», являются генетические экспертизы. Это очень сложные и важные исследования, результаты которых имеют порой решающее значение для дела. Следователь В.

предоставил эксперту возможность отобрать для исследования образцы с эксгумированного трупа предполагаемого лица Х. (зубы с верхней челюсти предполагаемого лица, эпифиз кости и кости запястья левой руки), а также предоставил образцы крови О., матери Х.

Требовалось ответить на вопрос: принадлежат ли предоставленные на экспертизу зубы и костные фрагменты одному человеку, и если да, то принадлежат ли данные объекты сыну О., лицу Х?

С помощью применения методов выделения ДНК из костей, а также путем определения митотипа митохондриальной ДНК экспертом были установлены значительные совпадения в исследуемом материале и образцах.

В процессе исследования, с целью исключения возможной контаминации ДНК, полученной из костного материала, молекулами ДНК, выделенными из объекта, сначала был проведен полный анализ костного материала. Было установлено, что в костном материале наблюдаются сильно разрушение молекулы ДНК.

По всей видимости, это можно было объяснить длительным промежутком времени, прошедшим с момента захоронения трупа и, как следствие, наступлением стадии скелетирования трупа.

При этом чем плотнее костная ткань, тем лучше произошло сохранение молекул ДНК, и этот показатель снижался в ряду зуб — кости левой кисти — костный эпифиз.

Кроме того, перед экспертом встал вопрос: если совпадение признаков было установлено, то какова вероятность того, что это совпадение закономерно, а не произошло по воле случайности? На этот вопрос эксперт получил ответ, используя формулу вычисления условной вероятности, выведенную Байесом, которая показала вероятность генетической общности происхождения объектов, равную 0.9999, или 99,99 %

По результатам исследования эксперт пришел к выводу, что предоставленные на экспертизу зубы, фрагмент кости левой кисти руки и эпифиз трубчатой кости принадлежат одному человеку, и исследованные костные останки принадлежат сыну О. — Х. Было установлено, что вероятность того, что костные останки принадлежат Х., составляет 99,99 %.

К специалистам АНО «Судебный эксперт» обратился Б., сотрудник организации «Кемеровский промышленный транспортный комбинат», которая оказалась вовлечена в мошенническую схему. Мошенники использовали наименование «Кемеровский промышленно-транспортный комбинат». Требовалось установить, можно ли считать данные названия тождественными.

Одним из наиболее интересных видов исследований, проводимых в АНО «Судебный эксперт», является видеотехническая экспертиза. Лицо К. направило на исследование цифровую запись, разделенную на 10 отрезков. Эксперту предстояло установить, присутствуют ли на записи признаки монтажа.

Одними из наиболее интересных задач, решаемых экспертами АНО «Судебный эксперт», являются задачи исследования в области экспертизы объектов интеллектуальной собственности. Следователь города Н.

предоставил на исследование пачку сигарет с размещенным на ней товарным знаком «Х», а также свидетельства на товарный знак «У», и поставил на разрешение экспертов следующий вопрос: является ли исследуемое обозначение, изображенное на пачке сигарет, маркируемой товарным знаком «Х», сходным до степени смешения с зарегистрированным товарным знаком «У»?

Одной из довольно редких, но не менее важных задач, которые ставятся перед экспертами АНО «Судебный эксперт», является проведение ветеринарной экспертизы. Арбитражный суд города Н.

представил экспертам материалы гражданского дела и поставил перед ними следующие вопросы: «Соответствовали ли условия содержания, кормления, ветеринарно-санитарное обслуживание заболевших животных, застрахованных по договору страхования, установленным нормам и правилам на дату происшествия (падеж животных)?», «В случае выявления нарушений условий содержания, кормления, санитарно-ветеринарного обслуживания заболевших животных, застрахованных по указанным договорам страхования, установленным нормам и правилам на дату происшествия определить, явились ли данные нарушения причиной гибели застрахованных животных.».

Довольно редкой, но очень интересной задачей, которая ставится на разрешение перед экспертами АНО «Судебный эксперт», является гомологическая экспертиза драгоценных металлов и камней. Лицо Л.

направило эксперту кольцо золотое 585 пробы с выпавшей из закрепки вставкой и серьги золотые 585 пробы со вставками из культивированного жемчуга, и поставило на разрешение эксперту вопрос: «Установить наличие производственного брака в кольце.

Является ли производственный брак причиной выпадения камня из кольца?».

Часто на разрешение специалистов АНО «Судебный эксперт» поступают вопросы об установлении принадлежности объекта к драгоценным камням. Этот вопрос с лёгкостью решает эксперт в области геммологических экспертиз. Лицо А. предоставило в АНО «Судебный эксперт» камень черного цвета и перед экспертами поставило вопрос – Являются ли представленный камень драгоценным.

Арбитражный суд города Москвы обратился в Центр по проведению судебных экспертиз и исследований для проведения патентоведческой экспертизы по иску ООО «Э…» к ООО «С…».

На разрешение эксперта был поставлен вопрос о выявлении факта использования в стеклопластиковых нагревателях, введенных в гражданский оборот ООО «С…», каждого признака полезной модели «Стеклопластиковый трубчатый электрический нагреватель» формулы полезной модели, указанной в патенте №…, патентообладателем которого является ООО «Э…».

Источник: https://sudexpa.ru/practice/vydelenie-dnk/

Лечение Костей
Добавить комментарий